Очистка кварцевых кювет для CD-спектроскопии: полное лабораторное руководство

Спектр кругового дихроизма вашего белка вчера выглядел идеально. Сегодня базовая линия изгибается ниже 215 нм, соотношение сигнал/шум рухнуло, а аппроксимация вторичной структуры показывает, что альфа-спираль упала с 40 процентов до 25 процентов. В образце ничего не изменилось. В держателе для образцов сидит обычный подозреваемый: грязная кварцевая кювета. Очистка кварцевых кювет для КД-спектроскопии — это рутинный шаг, который лаборатории недооценивают, и это первое, на что следует обратить внимание, когда качество данных неожиданно ухудшается.

Основной вывод можно сделать с самого начала: кювета, которая выглядит идеально чистой в видимых длинах волн, все же может быть катастрофически грязной при длине волны от 190 до 230 нм, где проводится большинство измерений КД белка. Разница между пригодной для использования базовой линией и испорченным спектром зачастую слишком тонка, чтобы ее можно было увидеть. В этом руководстве объясняется, почему спектроскопия КД исключительно чувствительна к состоянию кюветы, как идентифицировать каждый тип загрязнений, какой метод очистки восстанавливает оптическую поверхность, какие ошибки приводят к необратимым повреждениям и как проверить, действительно ли кювета готова к измерению.

Приведенные ниже протоколы представляют собой практические процедуры, используемые в повседневной работе по биофизике белков. Они совместимы с кварцевыми кюветами и кюветами из кварцевого стекла от любого известного производителя кварцевых кювет, и их заказывают от наименее агрессивного ежедневного ополаскивания до более глубоких этапов обеззараживания, используемых только тогда, когда обычной очистки недостаточно.

Почему КД-спектроскопия предъявляет высокие требования к чистоте кювет

Круговой дихроизм измеряет крошечную разницу в поглощении между левым и правым светом с круговой поляризацией. Типичная полоса CD в десять миллиградусов соответствует разнице в поглощении примерно 3 x 10^-4 а.е., что в десять-сто раз меньше, чем полосы поглощения, регистрируемые в обычном УФ-Вид спектре. Таким образом, любой оптический артефакт в кювете не является небольшой поправкой; это конкурирующий сигнал, который может превышать реальный спектр. Эта чувствительность является причиной того, что чистые кюветы являются предпосылкой для достоверных данных компакт-диска, а не деталью, которую нужно оптимизировать позже.

Дальняя УФ-область создает дополнительную нагрузку на оптический материал. Ниже 200 нм вода, растворенный кислород и даже высокочистые буферные компоненты заметно поглощают воду. Окно из плавленого кварца должно пропускать как можно больше и без того ограниченного света. Грязное или поврежденное окно уменьшает поток фотонов, заставляет детектор работать с более высоким коэффициентом усиления и увеличивает шум быстрее, чем в большинстве других методов спектроскопии. На практике КД в дальнем УФ-диапазоне ниже 210 нм является наиболее требовательным применением кюветы, с которым может столкнуться лаборатория.

Состояние кюветы влияет на данные компакт-диска посредством четырех независимых механизмов. Во-первых, поглощающая пленка уменьшает проходящий свет и повышает напряжение на диноде фотоумножителя. Во-вторых, частицы и микроцарапины рассеивают свет, который обнаруживается как смещение базовой линии и шум. В-третьих, механическое напряжение или травление кварца приводит к двойному лучепреломлению, которое преобразует линейно поляризованный свет в кажущийся артефакт эллиптичности. В-четвертых, шероховатая или наплавленная поверхность изменяет эффективную длину пути, на которой фактически исследуется луч. Каждый механизм приводит к разным паттернам отказов, поэтому необходима систематическая стратегия очистки.

Выбор материала кюветы определяет, насколько далеко в дальний УФ-излучение может проникнуть прибор. Синтетический плавленый кварц марки JGS1 прозрачен при длине волны ниже 180 нм и является стандартом для белкового КД в дальнем УФ-диапазоне. Природный плавленый кварц, обозначенный JGS2, пропускает свет примерно до 200 нм и приемлем для КД ближнего УФ-излучения и повседневной работы в УФ-ВИДе. Кварц JGS3 оптимизирован для передачи инфракрасного излучения и ему не место в кювете компакт-диска. Боросиликатное стекло сильно поглощает волны ниже 320 нм и совершенно непригодно для компакт-дисков.

Даже чистая кювета может оказаться непригодной для использования, если поцарапать окно. Царапины рассеивают свет и создают локальные изменения длины пути; они также собирают загрязнения во время следующего цикла очистки, и их практически невозможно удалить. Вот почему очистка неотделима от обращения: небрежное использование приводит к поломке даже самого лучшего протокола.

Распространенные загрязнители и как они искажают спектры CD

Даже когда кюветы используются исключительно с водой высокой чистоты и буферами, пригодными для ВЭЖХ, накапливаются пленки загрязнений. Сами биологические образцы являются наиболее распространенным источником, поскольку белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и липиды имеют тенденцию адсорбироваться на поверхностях плавленого кварца. Контакт с кожей, лабораторная атмосфера и даже упаковочные материалы добавляют свои отложения. Определение типа пленки полезно, поскольку каждый класс загрязнения реагирует на разные химические чистящие средства.

Чтобы понять, почему важна дисциплина очистки, рассмотрим, что на самом деле делает тонкая пленка загрязнений на длине волны, соответствующей CD. Столбцы ниже показывают репрезентативные значения кажущегося поглощения, добавленные при 220 нм различными типами примесей, оставленными в кварцевой кювете. Эта длина волны находится внутри дальней УФ-области, где пептидный хромофор производит самые сильные сигналы CD. Значения являются иллюстративными и основаны на наблюдениях, предоставленных лабораториями, занимающимися разработкой методов. Считайте их практической оценкой: чем больше добавленная поглощающая способность, тем более агрессивно необходимо удалять загрязнения во время очистки.

Отпечатки пальцев являются наиболее опасным распространенным загрязнением, что удивляет многих пользователей. Кожные выделения содержат аминокислоты, мочевину и жирные кислоты, которые сильно поглощают волны ниже 250 нм. Одно случайное прикосновение к оптической поверхности может добавить более 0,1 а.е. при длине волны 220 нм. Белковые пленки занимают второе место, и они самые коварные, поскольку монослой невидим для глаза. Даже субмонослойная белковая пленка имеет наклонную базовую линию в амидной области. Наклон часто ошибочно принимают за дрейф прибора или несоответствие буфера. Кристаллы соли и пыль действуют в основном как рассеивающие центры, а не поглотители. Рассеяние создает шум и вертикальное смещение, которые невозможно устранить простым вычитанием пустого изображения. Остатки растворителя — это проблема, которую легче всего устранить, но их присутствие обычно указывает на то, что этап промывки был выполнен в спешке. Абсолютные значения в таблице являются репрезентативными, а не универсальными; они зависят от толщины пленки, точной длины волны и длины пути кюветы. Важен порядок величины: примеси в диапазоне от 0,05 до 0,1 а.е. отделяют плоскую базовую линию CD от той, которая выходит за пределы полезного диапазона. Практический вывод заключается в том, что визуально идеальная кювета все равно может быть грязной в дальнем УФ-диапазоне, поэтому проверка никогда не является обязательной.

Чтобы сравнение было конкретным, в ухоженной кварцевой кювете, наполненной водой, смещение базовой линии должно быть ниже 0,01 а.е. на длине волны 220 нм. Как только смещение превысит 0,05 а.е., спектр CD покажет повышенную зашумленную базовую линию ниже 220 нм, и деконволюция вторичной структуры станет ненадежной. В базах данных спектров эталонных белков предполагается, что вклад кюветы незначителен; воспроизведение этих условий требует той же дисциплины очистки, которую используют справочные лаборатории.

Очистка кварцевых кювет для CD-спектроскопии: стандартный ежедневный протокол

Ежедневный протокол разработан с одной целью: удалить образец до того, как он сможет окончательно адсорбироваться. Для кювет, используемых в компакт-дисках, очистка является частью рабочего процесса измерений, а не случайной рутинной работой. Кювета, которая правильно промывается после каждого измерения, редко нуждается в агрессивной глубокой очистке. Вся последовательность занимает около пяти минут и используются только реагенты, безопасные для кварцевого стекла.

1. Сразу после измерения удалите образец пипеткой. Не выливайте его; пересыпание капель листьев над оптическим путем, которые высыхают и загрязняют верхние стенки.
2. Промойте ячейку два или три раза одним и тем же буфером или 10–30 мкл свежего буфера, затем выбросьте. На этом этапе удаляется основная часть белкового раствора, пока он еще полностью растворим.
3. Промойте не менее десяти раз сверхчистой водой (18 МОм·см). Цель — не однократная промывка, а полное вытеснение буфера и его солей.
4. Если образец содержит белок, липид или биологическую матрицу, заполните кювету 1–2-процентным раствором нейтрального, совместимого с кварцем лабораторного моющего средства и оставьте на пять-десять минут.
5. Еще раз промойте десятью-пятнадцатью объемами сверхчистой воды, чтобы удалить все следы моющего средства. Остаточное поверхностно-активное вещество сильно поглощает при длине волны 220 нм и создает базовую линию, которая выглядит точно так же, как загрязнение белка.
6. Промойте двумя или тремя объемами метанола или этанола оптической чистоты. Спирт вытесняет воду, растворяет гидрофобные остатки и значительно сокращает стадию сушки.
7. Высушите кювету слабой струей фильтрованного азота, чистого сухого воздуха или аргона. Не протирайте оптические поверхности; протирание сухой поверхности является частым источником микроцарапин.
8. Закройте кювету крышкой или храните ее в чистом пыленепроницаемом футляре. Кювета, которая остается открытой для воздуха на столе, соберет пыль в течение нескольких минут.

Несколько практических моментов определяют разницу между идеальным базовым уровнем и маргинальным. Всегда сливайте жидкость из кюветы с помощью пипетки, а не переливайте ее. Используйте большие объемы: промывка на 10 объемов означает увеличение внутреннего объема кюветы в десять раз, а не на десять капель. Заключительная промывка метанолом или этанолом настоятельно рекомендуется для работ CD, поскольку метанол быстро испаряется и предотвращает появление водяных пятен. Например, хорошо известный протокол CD предусматривает промывку водой и метанолом с использованием установки для очистки кювет и сушку азотом; эта простая формула остается эталоном для рутинной работы.

Конструкция кюветы также влияет на надежность ежедневного протокола. Полностью сплавленный цельный элемент не имеет склеенных швов, которые могут задерживать растворитель или отслаиваться после многократной очистки. Кварцевые кюветы этого типа при необходимости можно обрабатывать ультразвуком, тогда как с двухкомпонентными сцементированными ячейками необходимо обращаться более осторожно. Когда вы выбираете новую кювету для работы с компакт-диском, стоит убедиться, что оптические поверхности изготовлены из полированного кварцевого стекла и что геометрия полностью проплавлена.

Кювета из плавленого кварца для УФ-Вид и флуоресценции Эта кювета из полностью плавленого кварца подходит для поглощения и флуоресценции в диапазоне от 170 до 2700 нм. Его полированные оптические поверхности и прочная конструкция обеспечивают глубокую очистку и надежную ежедневную проверку. Посмотреть продукт →

Глубокая очистка стойких пленок и осадков

Если кювета не проходит проверку после ежедневного протокола, оправдана более глубокая очистка. Ключевой принцип – выбирать реагент, который воздействует на отложения, не повреждая кварц. Плавленый кварц химически прочен, но не неразрушим: он растворяется в плавиковой кислоте и медленно травится в горячей концентрированной щелочи. Каждый приведенный ниже рецепт глубокой очистки учитывает эти ограничения.

Белковые пленки лучше всего удалять пищеварением, а не агрессивными химическими методами. Стандартный подход — раствор пепсина в концентрации 1–2 мг/мл в 0,1 М соляной кислоте, инкубированный при 37 градусах Цельсия в течение одного-двух часов. Фермент расщепляет адсорбированный белок на мелкие пептиды, которые легко смываются. После инкубации кювету тщательно промойте сверхчистой водой, затем метанолом и высушите азотом. Другой эффективный вариант — 0,5–1-процентный раствор додецилсульфата натрия, нагретый до 40–50 градусов Цельсия, который растворяет белки и липиды; его необходимо промыть еще тщательнее, потому что SDS сам поглощает дальний ультрафиолет.

Соляные отложения и минеральные отложения реагируют на разбавленную кислоту. Азотная кислота в концентрации от 1 до 2 М является обычным выбором, поскольку она растворяет большинство неорганических остатков и не оставляет ничего после промывания. Выдержите 15–30 минут при комнатной температуре. Не совмещайте очистку кислотой с обработкой ультразвуком, поскольку вибрация воздействует на открытые края грунта и ускоряет реакцию. Общие органические пленки удаляются последовательностью растворителей: метанол, затем ацетон, затем этанол, затем вода. Эта последовательность начинается с растворителя, смешивающегося с водой, растворяет гидрофобные пленки и заканчивается растворителем, который смешивается с водой так, что не происходит стадии осаждения. Последняя промывка водой удаляет все следы органических растворителей. Ацетон сам по себе не идеален в качестве первого шага при очистке влажной кюветы, загрязненной солью, поскольку ацетон осаждает соли и может фиксировать белки на поверхности.

Съемные кюветы требуют другой техники. Окна следует разделить, очистить по отдельности на плоской поверхности из ПТФЭ или протереть поверхность чистой комнаты безворсовой тканью, смоченной растворителем, и высушить в потоке чистого воздуха. Распространенной ошибкой является чрезмерная затяжка металлического корпуса после очистки; это искажает окна и создает деформационное двойное лучепреломление, а это именно то, чего не могут допустить измерения CD. Соберите заново, затянув вручную плюс небольшой оборот, и проверьте длину пути с помощью эталонного раствора.

Ультразвуковая очистка может ускорить каждую описанную выше процедуру, но только для полностью сплавленных цельных кювет. Если кювета имеет заклеенное окно, соединение может протекать или разрушаться под воздействием ультразвуковой вибрации. В случае сомнений проверьте документацию поставщика, прежде чем помещать кювету в ультразвуковую ванну. Кювета, изготовленная из массивного толстостенного кварца, может выдерживать стандартные лабораторные циклы обработки ультразвуком продолжительностью от 5 до 10 минут, но тонкостенные флуоресцентные ячейки более хрупкие.

Чего следует избегать: ошибки при чистке, которые повреждают кварцевые кюветы

Чаще всего необратимые повреждения кювет вызваны не пробами, а ошибками очистки. Сам материал химически стабилен, но тонкие полированные окна уязвимы к воздействию реагентов, абразивов и неосторожному обращению. Понимание режимов отказа защищает как кювету, так и данные компакт-диска. В таблице ниже приведены наиболее распространенные ошибки и их последствия.

Раствор Пираньи, смесь концентрированной серной кислоты и перекиси водорода, иногда используется при чистке микроэлектроники. Для оптических кювет это обычно не рекомендуется. Реакция является экзотермической и может привести к травлению или помутнению кварца при повышении температуры; это также представляет серьезную угрозу безопасности лабораторных исследований. Если отложения устойчивы к азотной кислоте и моющим средствам, замена кюветы более экономична, чем рисковать в ванне с пираньями.

Как убедиться, что кювета действительно чистая перед измерением компакт-диска

Верификация — это шаг, который пропускают большинство лабораторий, и именно этот шаг позволяет выявить проблемы еще до сбора данных. Одной только визуальной проверки недостаточно, поскольку большинство фильмов, относящихся к компакт-дискам, являются субмонослойными. Следующая последовательность действий переходит от простой проверки к инструментальным испытаниям.

• Визуальный осмотр: держите чистую пустую кювету под углом на ярком фоне и ищите полосы, кристаллы, волокна или помутнение на оптических поверхностях.
• Тест на водяную пленку: наполните сверхчистой водой и слейте ее; чистая поверхность плавленого кварца остается полностью смоченной, а гидрофобная пленка вызывает образование капель воды.
• Сканирование с УФ-передачей: залейте сверхчистой водой и сканируйте от 190 до 400 нм на воздухе; кажущееся поглощение при 220 нм должно быть ниже 0,05 AU, а значение при 280 нм ниже 0,01 AU.
• Тест базовой линии на компакт-диске: поместите кювету, наполненную водой, в прибор и запишите базовую линию в рабочем диапазоне; базовая линия должна быть ровной в пределах плюс-минус 0,5 мград, а напряжение на диноде должно оставаться на нормальном уровне для данной модели прибора.
• Наложение реплик: соберите три последовательных скана одного и того же образца; они должны перекрываться в пределах уровня шума, и любое ступенчатое изменение или дрейф указывает на движущуюся пленку или пузырь.
• Проверка эталонного стандарта: для новых ячеек или после повторной сборки съемных ячеек проверьте с помощью сертифицированного эталона, такого как камфорсульфоновая кислота, и убедитесь, что полоса около 290,5 нм соответствует ожидаемому значению длины пути.

Приведенные выше пороговые значения являются практическими значениями по умолчанию, используемыми в лабораториях белкового CD. Кювета, прошедшая все шесть проверок, не будет ограничивающим фактором в ваших измерениях. Если проверка не удалась, повторите глубокую очистку один раз; если он снова выйдет из строя, замените элемент вместо того, чтобы тратить больше часов на безнадежное дело.

Выбор подходящей кварцевой кюветы для уменьшения нагрузки на очистку и уменьшения количества оптических артефактов

Лучший протокол очистки начинается с принятия решения о покупке. Кювета, правильно предназначенная для компакт-дисков, будет очищаться быстрее, легче проверяться и обеспечивать более воспроизводимые базовые линии в течение всего срока службы. Доминируют три решения: сорт материала, конструкция ячейки и длина пути.

Марка материала определяет самую короткую пригодную для использования длину волны. Для дальнего УФ-излучения ниже 210 нм укажите синтетический кварцевый кварц JGS1 с документально подтвержденной передачей в диапазоне от 170 до 220 нм. Плавленый кварц JGS2 приемлем для измерений с длиной волны выше 210 нм. Класс должен быть указан в сертификате поставщика; если это не так, то, вероятно, кювета не предназначена для компакт-дисков. Конструкция определяет совместимость очистки. Полностью слитые цельные элементы не содержат органического клея и могут быть пропитаны любым из перечисленных выше чистящих растворов, включая кратковременную обработку ультразвуком. Цементированные ячейки дешевле, но не подходят для агрессивной очистки. Съемные ячейки обеспечивают лучший доступ к окнам для глубокой очистки и являются стандартным выбором для очень коротких путей. На картах ниже приведены стандартные длины путей и рекомендуемые для них приложения для компакт-дисков.

Помимо длины пути, рассмотрим полный оптический путь. Лицевые поверхности окон должны быть отполированы до уровня царапин, а кювета не должна иметь двойного лучепреломления от деформации; простой тест между скрещенными поляризаторами выявляет чрезмерную нагрузку. Кюветы с черными стенками или замаскированными окнами полезны для исследований флуоресценции, но не нужны для стандартного компакт-диска. Безметалловая конструкция является преимуществом, если кювета будет использоваться с буферами, которые воздействуют на металлический каркас.

Прозрачная кювета из кварцевого стекла для оптических приборов Эта кварцевая кювета, разработанная для УФ-ВИД и флуоресцентных спектрофотометров, устойчива к большинству химикатов и выдерживает высокие рабочие температуры. Его оптическая прозрачность и долговечность делают использование и длительное хранение практичным. Посмотреть продукт →

Хранение, обращение и регулярное обслуживание для длительного срока службы кюветы

От того, как кювета хранится и с ней обращаются между измерениями, зависит частота ее очистки. Окна из плавленого кварца собирают пленки из переносимой по воздуху пыли, отпечатков пальцев и даже паров органических растворителей, хранящихся в том же шкафу. Следующие привычки помогут сохранить кювету в оптическом состоянии на долгие годы.

Правила обращения: держать кюветы только за матовые боковые стенки или верхний край, надевать неопудренные нитриловые перчатки, при переносе кювет использовать пинцеты с тефлоновыми наконечниками. Никогда не прикасайтесь к полированным оптическим поверхностям. Используйте специальный футляр для кювет с мягкой подкладкой для хранения и транспортировки и держите кюветы вертикально или горизонтально на чистой безворсовой поверхности. Контакт стекла со стеклом, который происходит, когда кюветы сложены в ящике, является распространенным источником сколов по краям.

Правила хранения: хранить кюветы пустыми и сухими, со снятыми или неплотно расположенными крышками или пробками, чтобы внутри не конденсировалась влага. Не храните кюветы погруженными в растворитель, метанол или воду; длительный контакт с растворителем может размягчить сцементированные клетки, а стоячая вода способствует образованию водорослей или бактериальных пленок. Повторно очистите хранившуюся кювету после более чем одной недели простоя, поскольку даже при хранении без пыли на кварце может накапливаться тонкая органическая пленка.

График технического обслуживания: еженедельно проверяйте все кюветы для компакт-дисков на наличие видимых пленок и царапин; выполняйте глубокую очистку ежемесячно или раньше, если базовые проверки уже не являются чистыми; замените кювету после двух последовательных неудачных проверок. Если лаборатория использует CD каждый день, держите по крайней мере две одинаковые кюветы на каждую буферную систему, чтобы одну можно было очищать, пока другая используется. Быстрое сканирование УФ-ВИД чистой пустой кюветы каждые несколько месяцев показывает, медленно ли стареет окно.

Приобретение кварцевых кювет у надежного производителя или поставщика.

Для лабораторий, дистрибьюторов и OEM-покупателей долгосрочная стоимость кюветы определяется ее консистенцией и способностью к очистке, а не ее первоначальной ценой. Кювета от производителя кварца с контролируемым сырьем оптического качества и документированной обработкой будет воспроизводиться в течение многих лет; дешевый элемент неопределенного качества будет производить незначительные изменения базовой линии, которые трудно отследить. Именно поэтому закупки следует рассматривать как часть системы качества.

Когда вы запрашиваете расценки у производителя или поставщика кварцевых кювет, попросите конкретную документацию. Марку материала следует указывать как JGS1, JGS2 или эквивалентное международное обозначение. Поставщик должен предоставить измеренную кривую пропускания в диапазоне от 190 до 260 нм, допуск на длину пути плюс-минус 0,01 мм или выше, а также подтверждение того, что окна не подвергаются деформации. Для работы с компакт-дисками сертификация без деформации более важна, чем для УФ-ВИД, поскольку двойное лучепреломление создает прямой оптический артефакт. Запросите также совместимость очистки элемента: полностью ли он сплавлен или сцементирован, и можно ли его обрабатывать ультразвуком.

Для оптовиков и дистрибьюторов, осуществляющих оптовые закупки, упаковка и отслеживаемость имеют такое же значение, как и оптика. Клетки должны поступать в индивидуальных защитных футлярах с номерами партий на этикетке. Согласованность от партии к партии имеет решающее значение; Сертификат на каждую партию предотвращает ситуацию, когда одна кювета ведет себя иначе, чем другая. Стоит поинтересоваться, предлагает ли производитель нестандартные размеры, разборные конструкции и нестандартные окна без больших минимальных партий. Yancheng Mingyang Quartz Products Co., Ltd. является производителем кварцевых изделий в Яньчэне, Китай, и является производственным предприятием Jinzhou Mingde Quartz Glass Co., Ltd.; Компания производит кварцевые кюветы, лабораторную кварцевую посуду, оптические кварцевые пластины и кварцевые компоненты на заказ для лабораторных и промышленных заказчиков по всему миру. Прямые отношения с производителем дают покупателю контроль над классом, сертификацией и изготовлением по индивидуальному заказу.

Часто задаваемые вопросы об очистке кварцевых кювет для CD-спектроскопии

Сопутствующие ресурсы и информация о продукте

Технические характеристики кювет, стандартную геометрию и доступные марки кварца из производственного ассортимента см. кварцевые кюветы для спектроскопии страница.

Если для вашего приложения CD требуется нестандартная длина пути, съемная конструкция или особый тип плавленого кварца, изготовление кварцевой посуды на заказ Сервис поддерживает единичное и серийное производство.

Являясь производителем и поставщиком кварцевых изделий, компания Yancheng Mingyang Quartz Products Co., Ltd. производит кварцевые кюветы, лабораторную кварцевую посуду, оптические кварцевые пластины и сопутствующие компоненты для КД-спектроскопии, УФ-ВИД-анализа и других оптических приложений. Компания работает как производственное предприятие Jinzhou Mingde Quartz Glass Co., Ltd., обслуживая лабораторных, промышленных и оптовых клиентов на мировых рынках.